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lunedì, 2 Ottobre 2023

Agrumi: per le malattie è corsa contro il tempo

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Eliminare porzioni di DNA/geni estranei alla pianta da modificare, così da produrre editing puliti (marker-free, liberi da marcatori), limitando la possibilità di ricadere nella casistica degli organismi geneticamente modificati, è uno degli obiettivi più ambiziosi di quanti usano le TEA per migliorare le piante arboree. Vediamo come il CREA, mediante il genome editing, sta lavorando per ottenere arance e pompelmi resistenti al cancro batterico e alle ultime minacce fitosanitarie.  

Gli agrumi rappresentano una delle specie arboree da frutto più diffuse e importanti al mondo, considerate le proprietà salutistiche e l’apporto nutrizionale conferito ai frutti da vitamine, sali minerali, e composti antiossidanti. Per quanto concerne il miglioramento di questa coltura, gli agrumi (in quanto specie arboree da frutto) hanno dei limiti che valgono sia quando si usano gli incroci che le Tecnologie di Evoluzione Assistita (TEA), ovvero genome editing e cisgenesi.  

Il ruolo delle Tecnologie di Evoluzione Assistita negli agrumi nel mondo 

Dal 2014 ad oggi gli agrumi sono stati oggetto di circa 40 pubblicazioni, non tantissime se le paragoniamo ad altri fruttiferi, come ad esempio vite e melo, decisamente di maggior impatto e attorno ai quali si concentrano interessi economici e protezione di marchi di gran lunga superiori agli agrumi e su cui lavorano molte più Istituzioni. Ciononostante, in poco meno di 10 anni, sono state pubblicate diverse review, a firma di gruppi di ricerca che operano in diversi Paesi, che hanno fatto il punto sullo stato dell’arte e sugli avanzamenti metodologici e scientifici delle TEA in agrumi. 

Tenendo conto di quanto velocemente si evolvano queste tecnologie dal punto di vista metodologico e applicativo, è possibile leggere lavori che comparano l’efficienza delle proteine Cas (ad esempio, Cas9 e Cas12 entrambe parti integranti del complesso CRISPR/Cas ovvero delle “forbici molecolari” sotto il quale principio scientifico si basa il genome editing). Alcuni lavori introducono anche in agrumi la peculiarità dell’editing non tanto come modifica di una piccola regione di DNA (genome editing), quanto della sostituzione specifica di una base nucleotidica con un’altra (base editing), tecnicamente molto più specifica, ma anche più complessa da indurre. Infine, altri lavori sono indirizzati a riprodurre una mutazione in entrambi gli alleli (ovvero in entrambe le copie di un gene), in modo da aumentarne l’efficienza.  

Eliminare porzioni di DNA/geni estranei alla pianta da modificare, così da produrre editing puliti (marker-free, liberi da marcatori), limitando la possibilità di ricadere nella casistica degli organismi geneticamente modificati, è uno degli obiettivi più ambiziosi di quanti usano le TEA per migliorare le piante arboree. Infatti, a differenza delle specie erbacee, come ad esempio i cereali (orzo, frumento, riso, avena) o le ortive come gli ortaggi (pomodoro, melanzane, peperoni), che hanno un ciclo vitale annuale, le specie arboree come gli alberi da frutto hanno un ciclo pluriennale. Ciò vuol dire che nelle condizioni migliori di allevamento muoiono per loro natura dopo diversi anni. Nel caso dei cereali è possibile ottenere piante pulite (marker-free) attraverso l’incrocio. Diversamente, le piante arboree impiegherebbero anni per ottenere lo stesso risultato. Quindi, bisogna trovare dei sistemi che, già in fase di utilizzo delle TEA, siano in grado di eliminare il DNA estraneo.  

Un gruppo di ricercatori spagnoli in collaborazione con l’Università di Catania ha messo a punto una single guide RNA (sequenza di DNA specifica che, una volta riconosciuta la stessa sequenza nella varietà, produce l’editing) e un costrutto per base editing capace di sostituire una base nel gene che rende gli agrumi sensibili all’erbicida imazapyr, rendendo così le piante resistenti senza dover integrare geni estranei agli agrumi. Questa single guide RNA, associata con qualsiasi altra single guide RNA per base editing di un gene di interesse, permette di migliorare la varietà in questione, senza alcuna integrazione di DNA estraneo, ottenendo direttamente una varietà migliorata marker-free.  

Un’altra via per ottenere piante marker-free sfrutta i protoplasti, cellule vegetali che, in quanto private di parete cellulare, posso acquisire in maniera transiente (ovvero, momentanea) la proteina Cas sotto forma di acidi nucleici o riboproteine. Di contro, l’editing ottenuto sarà stabile e quindi la modifica sarà trasferita a tutte le cellule che da questa si origineranno, dando vita alla nuova pianta migliorata. Gruppi di ricercatori della Florida hanno ottimizzato la trasformazione dei protoplasti, editando il gene PDS che quando disattivato decolora le foglie.  

Arance e pompelmi resistenti al cancro batterico degli agrumi grazie al genome editing 

Sarebbe impensabile usare le TEA senza conoscere il gene che controlla il carattere da migliorare e senza riuscire a rigenerare (produrre una intera piantina da una singola cellula modificata) la varietà migliorata. In agrumi il maggior numero di studi pubblicati sul genome editing ha riguardato la disattivazione dei geni che conferiscono suscettibilità/sensibilità al cancro batterico (CBC). Si tratta di una malattia causata da Xantomonas citri, diffusa in quasi tutte le aree agrumicole del mondo, ma non nei Paesi che si affacciano sul Bacino del Mediterraneo, sebbene a rischio per via della facile trasmissione della malattia. Il CBC crea lesioni su foglie, steli e su tutta la pianta, che impattano pesantemente sulla qualità dei frutti, deprezzandone la produzione.

Sintomi di cancro batterico degli agrumi (CBC) in (a) frutti con lesioni che tendono a confluire formando aree crateriformi fessurate, e (b) foglie di arancio le cui lesioni di colore verde scuro rotondeggianti tendono ad allargarsi diventando di colore marrone chiaro. (Foto di Marco Causo, CREA Centro di Ricerca Olivicoltura Frutticoltura Agrumicoltura – Acireale)

Ricercatori della Florida hanno utilizzato, con chiare evidenze di successo attraverso prove in laboratorio, il genome editing per spegnere almeno tre geni diversi che rendono arancio e pompelmo altamente suscettibili al cancro.

Esempio di genome editing nel gene CsLOB1 che mostra, rispetto alla sequenza non modificata wild type, le delezione (-) di “GA”, l’inserzione (+) di “A” e l’inserzione di “T” (Figura originale da “Genome editing of the disease susceptibility gene CsLOB1 in citrus confers resistance to citrus canker. Jia et al., 2017. Plant Biotechnology Journal 15, pp. 817-823”)

 

Il ruolo del CREA in Italia per fronteggiare Greening, Malsecco e Alternaria 

Gli agrumi patiscono un’altra minaccia fitosanitaria devastante a livello mondiale, che è il Greening (Huanglongbing, comunemente noto con il nome di HLB). Si tratta di una malattia causata dal batterio Candidatus Liberibacter veicolato dai vettori Diaphorina citri e Tryoza eritreae, diffusa in Cina, Sud America, Florida e California, Sud Africa, e che ha causato la morte di milioni di alberi e una riduzione della produzione di oltre il 74% con perdite economiche di centinaia di milioni di dollari. Purtroppo tutti gli agrumi di cui consumiamo e apprezziamo i frutti (arance, limoni, mandarini, pompelmi, pummeli, clementine, cedri, bergamotti) e altri che vengono utilizzati come portinnesti (agrumi che fungono da intermediari tra la varietà che produce i frutti e il terreno) sono suscettibili a questa malattia, nei riguardi della quale non esistono cure. Il Greening colpisce la pianta (impattando sulla produzione e deperendola fino alla morte) e i frutti (rendendoli non commercializzabili perché qualitativamente scadenti).

Sintomi di Huanglongbing (Greening o HLB) in pompelmo con tipica deformazione ed inversione di colore nel frutto (a) e maculature clorotiche gialle nelle foglie (b) (Foto di Marco Causo, CREA Centro di Ricerca Olivicoltura Frutticoltura Agrumicoltura – Acireale)

Questo significa che, se non si riesce a trovare una soluzione nell’arco di alcuni anni, si corre il rischio che gli agrumi possano scomparire. Nel corso degli anni, il tempo che intercorre dal rilevamento del vettore alla comparsa della malattia si è ridotto sempre più velocemente, passando da oltre 62 anni in Brasile, a poco più di 4 in California. Se pensiamo che i vettori sono stati rilevati in Spagna e Portogallo nel 2014 (T. erytreae) e in Israele nel 2022 (D. citri), la minaccia per l’agrumicoltura europea è davvero reale. Certamente i cambiamenti climatici stanno contribuendo a favorire la rapida diffusione del vettore e quindi della malattia.  

Tutta la comunità scientifica internazionale è concentrata per trovare rapidamente una soluzione, intervenendo con strategie di controllo sui vettori fino ad arrivare alla genetica, sia nella sua accezione classica che moderna. Le uniche fonti di resistenza ricadono in specie molto vicine agli agrumi, con i quali sono sessualmente compatibili, requisito essenziale sia perché è possibile sfruttare l’incrocio per introdurre la resistenza agli agrumi, sia perché è possibile usare le TEA, raggiungendo l’obiettivo in tempi decisamente più brevi. 

In Italia il CREA, con il suo Centro di Olivicoltura, Frutticoltura e Agrumicoltura (sede di Acireale), ha già completato il sequenziamento del genoma (quindi, ha la conoscenza di tutto il DNA) di una delle due specie resistenti, Eremocitrus glauca. Attraverso il confronto tra il genoma delle specie suscettibili già disponibili e quelle resistenti si stanno ultimando le ricerche volte alla identificazione dei geni responsabili del loro diverso comportamento nei riguardi di questa malattia. Inoltre, grazie al progetto CITRUS Biotech, sono state acquisite tutte le competenze per produrre i costrutti di genome editing e di cisgenesi e sono state ottimizzate anche le soluzioni marker-free. Nello specifico, questo approccio è stato ottenuto utilizzando due strategie: la prima sostituendo il gene della resistenza alla kanamicina con un gene che colora di rosso alcune parti delle piantine modificate (in questo modo la selezione avviene attraverso un marcatore visivo) ed è un gene molto simile a quello che rende rossi i frutti di arancio per via della presenza delle antocianine; la seconda con un sistema di sfruttamento delle regioni di DNA che vengono attivate quando esposte a temperature alte (48°C) per pochi minuti, portando alla eliminazione della porzione di DNA che include la resistenza alla kanamicina e la Cas9. Il CREA ha anche ottimizzato i protocolli di rigenerazione e trasformazione di diverse varietà di agrumi, che sfrutterebbe anche a vantaggio di questa applicazione. Questo vuol dire che, una volta identificati i geni di resistenza e di suscettibilità, potremmo essere pronti per sviluppare i primi costrutti per fare genome editing e cisgenesi in varietà di arancio e pompelmo

Disporre di queste conoscenze mette il CREA Olivicoltura, Frutticoltura e Agrumicoltura (CREA-OFA) in una posizione sicuramente vantaggiosa anche nei riguardi di altre due patologie su cui è attivamente impegnata.  

Il Malsecco è una malattia causata dal fungo Phoma tracheiphilus, che attacca la parte legnosa della pianta. Comparsa all’inizio del secolo scorso, ha registrato un grave peggioramento della produzione limonicola italiana, sia in termini quantitativi che qualitativi.

Sintomi di Malsecco. (a) Dettaglio di rametto di pianta infetta che mosta uno scolorimento del legno giallo o rosa-salmone a rossastro. (b) Pianta di limone Akragas morta a causa di Malsecco. (Foto modificate da “Identification of Field Tolerance and Resistance to Mal Secco Disease in a Citrus Germplasm Collection in Sicily. Russo et al., 2020. Agronomy 10, 1806)

Il CREA e l’Università di Catania hanno prodotto delle popolazioni di incrocio che, anche grazie alla recente disponibilità del genoma del limone Femminello Siracusano, saranno indispensabili per individuare marcatori e/o geni candidati coinvolti nella suscettibilità/resistenza al Malsecco su cui poter strategicamente intervenire sfruttando le TEA.  

Infine, un’altra malattia che ha un impatto più a livello Europeo è l’Alternaria causata dal fungo Alternaria alternata che colpisce frutti e foglie.

Sintomi di Alternaria in frutto e foglie di mandarino (Foto di Maria Concetta Strano, CREA Centro di Ricerca Olivicoltura Frutticoltura Agrumicoltura – Acireale)

Il Centro di Acireale ha già sviluppato due costrutti di genome editing, intervenendo su un gene candidato potenzialmente responsabile della malattia

Disporre delle conoscenze tecniche sulle TEA, consente di contribuire a risolvere alcune tra le minacce più pericolose per l’agrumicoltura mondiale, come il greening, collaborando con le Istituzioni site nei Paesi in cui la malattia esiste già, per tentare di fermarla prima che arrivi in Europa.

Inoltre, siamo in grado di “giocare in casa”, tentando di risolvere malattie decisamente meno impattanti a livello internazionale, ma che negli anni hanno fortemente limitato l’Italia nei processi di commercializzazione. In questo modo, le TEA contribuirebbero a portare il nostro Paese a riconquistare quegli spazi di mercato di cui un tempo era leader, come nel caso della limonicoltura.  

Concetta Licciardello, Primo ricercatore, CREA Centro di ricerca Olivicoltura Frutticoltura Agrumicoltura

Laureata in Scienze Biologiche, con un Dottorato in Biotecnologie vegetali e una Specializzazione in Biochimica Clinica. Lavora al CREA dal 2003 e si occupa di genetica, biologia molecolare e biotecnologie applicate allo studio della variabilità, del miglioramento della qualità dei frutti e della resistenza/tolleranza ai principali stress biotici e abiotici

#lafrase: Con gli occhi bassi, rivolti verso quella terra da cui proveniamo e che tanto ci dona

Angelo Ciacciulli, Ricercatore, CREA Centro di ricerca Olivicoltura, Frutticoltura e Agrumicoltura

Biotecnologo Vegetale, formatosi presso l’Università degli Studi di Milano. 

Applica le TEA agli agrumi per studiare geni e le loro possibili ricadute nel miglioramento varietale.

#lafrase: La scienza è la poesia della realtà (Richard Dawkins)

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