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venerdì, 8 Dicembre 2023

Agrumi: stessa identità, nuove qualità 

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La diversificazione delle varietà di agrumi è stata ottenuta dalle selezioni operate prima dagli agricoltori e poi dai breeder, conservando le mutazioni migliorative e scartando le altre. Oggi le Tecnologie di Evoluzione Assistita (TEA) permettono di ottenere le mutazioni migliorative desiderate in minor tempo e con una precisione quasi chirurgica. Quindi, a differenza degli agenti mutageni, con le TEA è possibile mantenere invariata l’identità e la peculiarità genetica delle varietà tipiche e migliorarle anche solo per una singola mutazione vantaggiosa 

Gli agrumi, originari del sud est asiatico, sono arrivati in Italia secoli fa, e qui si sono ambientati e diversificati, divenendo patrimonio culturale, parte integrante del panorama paesaggistico e della tipicità locale, sia con i prodotti freschi che trasformati. Gli agrumi più coltivati derivano dall’incrocio naturale tra poche specie antiche, come pummelo, mandarino selvatico e cedro. Il limone, ad esempio, deriva da cedro e arancio amaro, a sua volta ibrido di mandarino e pummelo. Anche arancio, pompelmo e clementine sono ibridi di mandarino e pummelo, ma sono figli di incroci ripetuti con uno dei due genitori. Gli agrumi che hanno avuto origine secoli fa hanno mantenuto la loro identità, come essenza della commistione dei caratteri ereditati dai loro genitori; infatti, grazie al tipo di riproduzione sessuale che gli deriva fondamentalmente dal mandarino e che prende il nome di apomissia, i semi di questi agrumi sono cloni della pianta madre. Questo vuol dire che, una volta generato l’incrocio e fissati i caratteri, questi si sono mantenuti nel tempo. 

Perché gli agrumi hanno bisogno delle TEA? 

In generale, a diversificare le varietà è stata la selezione fatta prima dagli agricoltori (volutamente o accidentalmente) e poi dai breeder, conservando le mutazioni migliorative e scartando le altre. In questo modo hanno operato facendo “selezione clonale”, col tempo divenuto uno dei principali strumenti operativi per i genetisti degli agrumi.  

La scoperta di agenti in grado di incrementare la comparsa di mutazioni casuali ha dato una spinta al miglioramento genetico classico, di cui un esempio è stato l’ottenimento di pompelmi rosa e senza semi. Se – da un lato – gli agenti mutageni hanno accelerato la comparsa di mutazioni utili (che naturalmente si verificherebbero molto meno frequentemente), sebbene in maniera del tutto casuale – dall’altro lato, però – è improbabile riprodurre la stessa mutazione in diverse varietà. Oggi le Tecnologie di Evoluzione Assistita (TEA) permettono di ottenere le mutazioni migliorative desiderate in minor tempo e con una precisione quasi chirurgica. Quindi, a differenza degli agenti mutageni, con le TEA è possibile mantenere invariata l’identità e la peculiarità genetica delle varietà tipiche e migliorarle anche solo per una singola mutazione vantaggiosa.  

Certamente queste nuove tecnologie hanno dei limiti: possono essere utilizzate solo se si ha (I) la capacità di rigenerare la varietà da migliorare partendo da una o poche cellule modificate, (II) la conoscenza dei geni da migliorare o delle mutazioni da riprodurre. Quindi, conoscere la peculiarità di una specie permette di riprodurla nelle varietà in cui quelle mutazioni non sono (ancora) insorte, ma che potrebbe succedere in un tempo indefinito.  

Gli agrumi non sono così semplici da studiare e quindi da migliorare, a differenza ad esempio di alcune specie erbacee. È pertanto sufficiente disporre di un buon genoma sequenziato dell’agrume che si vuole migliorare per poter individuare i geni già scoperti in altre specie. A quel punto questi verranno cercati nel DNA degli agrumi sequenziati, modificati e ne verrà valutato l’effetto sia a livello molecolare che fenotipico, quindi osservabile esternamente. Con questo approccio si ricorre al “trasferimento orizzontale” delle conoscenze fra le specie e, laddove non è possibile intervenire partendo dalla coltura di nostro interesse, si attinge alla conoscenza di quanto già noto in specie meno complesse. 

TEA per la qualità dei frutti di agrumi nel mondo 

Negli agrumi uno degli obiettivi principali del miglioramento genetico, usando sia un approccio classico sia moderno come le TEA, è indirizzato alla qualità dei frutti in senso lato, includendo tutti gli aspetti che contribuiscono a portare sulla tavola dei consumatori prodotti, appunto, di qualità. Dal 2014 ad oggi sono stati pubblicati alcuni studi che hanno visto in prima linea l’utilizzo delle TEA per migliorare diversi aspetti della qualità degli agrumi. Un esempio riguarda l’editing del gene Tiller Angle Control 1 in arancio al fine di cambiare l’architettura delle piante, perché anche questo aspetto può contribuire al miglioramento della qualità del frutto, in quanto viene semplificata la gestione delle piante in modo da aumentarne l’efficienza produttiva. Inoltre le spine, che possono essere piuttosto numerose nei rami delle piante di agrumi, feriscono i frutti rendendoli non commerciabizzabili e soprattutto più esposti a malattie. Uno studio è stato indirizzato a eliminare le spine, tramite editing dei geni THORN IDENTITY1 e THORN IDENTITY2 in Carrizo, tipico portinnesto degli agrumi.  

Esperimenti di “trasferimento orizzontale”, dedicati più specificatamente al frutto, sono stati eseguiti su un “mandarino cinese”, la Fortunella hindsii, agrume ornamentale la cui peculiarità è rappresentata dall’essere dotato di una fase giovanile di pochi mesi (a differenza di tutti gli agrumi che invece fioriscono e producono frutti anche dopo 10 anni), quindi perfetta per valutare caratteri del frutto in poco tempo. In questo mini-citrus ricercatori cinesi hanno provato a bloccare il processo attraverso cui i carotenoidi vengono convertiti in apocarotenoidi, rompendo il gene CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE4. In questo modo viene favorito l’accumulo dei carotenoidi, i composti che conferiscono il tipico colore arancione a tanta frutta e verdura, già descritti come sostanze antiossidanti importantissime per la salute umana. Nella stessa specie altri ricercatori cinesi hanno provato a produrre frutti senza semi “spegnendo” due geni già descritti in arabidopsis (specie erbacea utilizzata come modello per tutte le piante, per via della sua semplicità), DUO POLLEN 1 e SPOROCYTELESS. Purtroppo, nessuno di questi esempi di “trasferimento orizzontale” ha dato il risultato atteso, dimostrando che, in una base genetica troppo diversa, la singola mutazione può non avere l’effetto sperato.  

Il ruolo del CREA nell’utilizzo delle TEA per migliorare la qualità degli agrumi 

Nell’ambito del programma BIOTECH, il progetto CITRUS ha rappresentato un’importante opportunità per l’Italia – e in particolare per il CREA – perché per la prima volta le TEA sono state utilizzate per migliorare la qualità dei frutti di agrumi. Il Centro Olivicoltura Frutticoltura Agrumicoltura (CREA-OFA) di Acireale ha applicato con successo queste tecnologie, formando giovani ricercatori e portando in casa il know-how per ogni fase del processo che sottende l’utilizzo delle TEA, ottimizzando costrutti marker-free (necessari per produrre piante libere da DNA estraneo alla varietà che si vuole migliorare) e protocolli per rigenerare le varietà tipiche del territorio italiano, come le varietà di arancio ‘Doppio Sanguigno’, ‘Tarocco’, e ‘Vaniglia Sanguigno’.  

In collaborazione con la Fondazione Edmund Mach il genome editing e la cisgenesi sono state utilizzate per tentare di produrre agrumi i cui frutti sono arricchiti in composti nutraceutici come antocianine (la sostanza che colora di rosso intenso le arance siciliane) e licopene (il composto che conferisce il colore rosa al pompelmo) molto salutari per l’uomo.

Figura 1

È stato pubblicato il primo lavoro che ha dimostrato la fattibilità del genome editing su varietà di arancio con antocianine, intervenendo sul gene b-cyclase 2, convolto nella conversione del licopene in b-carotene. Per lo stesso fine è stata applicata anche la cisgenesi, inserendo in varietà con licopene (come il pompelmo rosa ‘Star Ruby’ e l’arancio ‘Vaniglia Sanguigno’) il gene Ruby di arancio ‘Moro’, già descritto per essere in grado di “accendere” la sintesi di antocianine.  

In collaborazione con l’Università di Catania, il CREA ha lavorato per togliere i semi nei frutti di alcuni agrumi, generalmente mandarini, in modo da permettere di rivalutare quelle varietà tipiche dal sapore e profumo inconfondibile, ma ormai quasi fuori mercato per la forte presenza di semi. In questo caso è stato editato il gene HAIKU 1, già descritto in arabidopsis come cruciale per il corretto sviluppo del seme.  

Nonostante i risultati siano stati già verificati in laboratorio, la lunga giovanilità degli agrumi non permetterà, prima di qualche anno, di vedere fiori e frutti. Per accorciare i tempi, in modo da anticipare la fioritura, si è intervenuto sui geni CENTRORADIALIS (CEN) e TERMINAL FLOWER 1 (TFL), sfruttando una sola guida in grado di intervenire contemporaneamente su entrambi i geni, così da aumentare la possibilità di “spegnerli” contemporaneamente. Sebbene queste piante non abbiano ancora fiorito, hanno però da subito mostrato un carattere direttamente associato alla modifica che è stata causata, ovvero la conversione delle gemme dormienti in spine.  

La produzione di piante pulite marker-free, libere da DNA estraneo, è uno degli obiettivi su cui tutta la comunità scientifica fa fronte comune. Il CREA ha sviluppato dei costrutti in cui, allo stesso tempo, è possibile (A) attraverso la cisgenesi di Ruby inserire le antocianine negli agrumi contenenti licopene, (B) anticipando la fioritura attraverso l’editing di CEN/TFL, (C) e produrre “piante pulite” utilizzando un marcatore visivo (per selezionare le piantine migliorate) come VvMybA1, un gene di vite che colora le foglie di viola. Ciò permette, nelle prime fasi, di osservare se le piante sono trasformate e, in una seconda fase, di capire se il gene stesso è stato eliminato, grazie alla cassetta per il marker free attivata dopo aver esposto le piante a temperature di 48°C per pochissimi minuti. Le piante ritornate verdi dopo il trattamento termico sono ripulite da tutti gli elementi essenziali per fare editing, ritornando quindi identiche alla varietà originale, tranne per i caratteri aggiunti.

Figura 2

Gli sforzi fatti per spingere la ricerca alla frontiera del settore, in modo da ottenere piante dalle caratteristiche migliorate, senza residui del processo di trasformazione e che vadano presto a frutto, si scontrano oggi con la legislazione vigente. Ciononostante, siamo fiduciosamente in attesa che la proposta di legge presentata in Parlamento lo scorso aprile sia celermente approvata per permettere di valutare queste piante in pieno campo. Solo così sarà possibile valorizzare davvero i prodotti della ricerca di eccellenza Italiana e salvare l’agrobiodiversità, rilanciando le varietà tradizionali, dopo aver corretto caso per caso il difetto che l’ha resa obsoleta per anni. 

Concetta Licciardello, Primo ricercatore, CREA Centro di ricerca Olivicoltura Frutticoltura Agrumicoltura

Laureata in Scienze Biologiche, con un Dottorato in Biotecnologie vegetali e una Specializzazione in Biochimica Clinica. Lavora al CREA dal 2003 e si occupa di genetica, biologia molecolare e biotecnologie applicate allo studio della variabilità, del miglioramento della qualità dei frutti e della resistenza/tolleranza ai principali stress biotici e abiotici

#lafrase: Con gli occhi bassi, rivolti verso quella terra da cui proveniamo e che tanto ci dona

Angelo Ciacciulli, Ricercatore, CREA Centro di ricerca Olivicoltura, Frutticoltura e Agrumicoltura

Biotecnologo Vegetale, formatosi presso l’Università degli Studi di Milano. 

Applica le TEA agli agrumi per studiare geni e le loro possibili ricadute nel miglioramento varietale.

#lafrase: La scienza è la poesia della realtà (Richard Dawkins)

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